Ova najstarija muzejska ustanova osnovana je 1844. godine na inicijativu srpskog književnika Jovana Sterije Popovića, od 1952. godine nalazi se u sadašnjem zdanju sagrađenom 1903. godine, po projektu arhitekata Nikole Nestorovića i Andre Stevanovića. U Muzeju se čuvaju praistorijske i klasične arheološke kolekcije, kolekcije vezane za srednjovekovnu kulturu i umetnost, kolekcije slikara od 18. do 20. veka, kolekcija inostranih umetničkih dela i bogato numizmatičko odeljenje.

Najvredniji eksponat u Narodnom muzeju je Miroslavljevo jevanđelje – najstariji i najdragoceniji rukopis napisan ćirilicom, nastao oko 1190. godine, po narudžbini humskog kneza Miroslava, o čemu govori zapis na poslednjem listu knjige. Tekst ove bogoslužbene knjige pisan je perom i sadrži 296 minijatura crtanih perom, a zatim bojenih četkicom crvenom, zelenom, žutom i belom bojom i ukrašenih zlatom. Miroslavljevo jevanđelje, kao najvredniji spomenik srpske kulture, dobio je i zvanično dobio epitet najlepšeg ćiriličnog rukopisa na svetu i upisan je u registar UNESCO – „Pamćenje sveta“. U sastavu Narodnog muzeja su i: Vukov i Dositejev muzej i Galerija fresaka.